Die strukturellen Geheimnisse des Enzyms verwendet werden, um beliebte Anti-Cholesterin- Medikament machen

In der pharmazeutischen Produktion , kann die Identifizierung Enzymkatalysatoren , die zur Verbesserung der Geschwindigkeit und Effizienz des Prozesses zu helfen ein großer Segen sein . Herauszufinden , warum ein bestimmtes Enzym so gut funktioniert, ist eine ganz andere Aufgabe .

Nehmen Sie die Cholesterinsenker Simvastatin . Zuerst vermarktet im Handel als Zocor , die Statin-Medikament hat generiert Milliarden Dollar Jahresumsatz. Im Jahr 2011 UCLA Wissenschaftler und seine Kollegen festgestellt, dass eine mutierte Enzym könnte dazu beitragen, produzieren die gefragten Pharma wesentlich effizienter als die chemische Prozess, der seit Jahren verwendet worden war - und konnte es besser als die natürliche , nicht-mutierte Version von der zu tun Enzym . Aber niemand recht wusste, warum , bis ein anderes Team von UCLA Forscher das Geheimnis geknackt .

Mit einer Kombination aus experimentellen Messungen und umfangreiche Computersimulationen , die interdisziplinäres Team von Wissenschaftlern - von drei Chemie, Biochemie und Verfahrenstechnik -Labors an der UCLA - ungedeckte wichtige Strukturmerkmale in der modifizierten Enzyms , die ihnen geholfen zu entsperren das Geheimnis ihrer Wirksamkeit versteckt. Ihre Ergebnisse werden in der Juni- Printausgabe von Zeitschrift Nature Chemical Biology veröffentlicht und sind derzeit online verfügbar.


Dies ist eine Darstellung der chemischen Struktur des mutierten Enzyms LovD9 verwendet, um die CholesterinsenkerSimvastatin herzustellen. Die Struktur des mutierten Enzyms und warum es wirksam bei der Herstellung von Simvastatin wurde durch Röntgenstrukturanalyse und Moleküldynamiksimulationen an der UCLA bestimmt.
Bildnachweis: UCLA / Codexis

Wie der Enzymkatalysator zuerst entdeckt

Simvastatin war bereits weit verbreitet , als die Wissenschaftler festgestellt, dass ein natürliches Enzym namens LoVD , ursprünglich aus einer Form im Boden gefunden geerntet, konnte reagieren und ein Medikament, ähnlich wie Simvastatin . Noch als Katalysator , seine Reaktionsgeschwindigkeit war für kommerzielle Herstellung zu gering.

So UCLA Professor Yi Tang arbeitete mit Wissenschaftlern an Codexis Inc., einem Entwickler von industriellen Enzymen und verwendet einen Prozess namens " gerichtete Evolution ", um eine mutierte Version des Enzyms, das für den industriellen Einsatz stabil war besser , schneller und erstellen.

" Gerichtete Evolution ist eine Labortechnik , die den natürlichen Evolutionsprozess nachahmt , aber in einem viel schneller Weise ", sagte Tang , der Dual- Termine in der Abteilung für Chemie und Biochemie und der Abteilung für chemische und molekularbiologische Technik hält .

Tang Labor und der Codexis Team erzeugt zufällig mutierte Versionen LoVD , jeweils mit einem etwas anderen Abfolge von Aminosäuren, die der Grundform und Funktion verändert . Das Team dann ausgewählt , diese Enzyme die meisten in der Lage, Simvastatin und wiederholte den Vorgang , um ihre Reaktionsfähigkeit weiter zu verbessern.

Nach neun Runden der gerichteten Evolution , hatten sie ein mutiertes Enzym sie LovD9 genannt , die von der ursprünglichen abweicht LoVD Enzym durch 29 verschiedene Mutationen identifiziert und die Simvastatin 1.000-mal effizienter produziert als das natürliche Enzym .

" Simvastatin hat mehrere komplizierte strukturelle Merkmale , so versucht, zu synthetisieren, es braucht Zeit und Geld chemisch ", sagte Gonzalo Jiménez- Osés , ein UCLA Postdoc und Erstautor der Zeitung . "Wenn Sie diese Verbindungen auf einfache Weise erzeugen, ist es eine große Verbesserung für die Herstellung von Drogen . "

Vor der Entwicklung des LovD9 Enzym , Simvastatin war durch ein mehrstufiges Verfahren, das teure und gefährliche chemische Reagenzien und Lösungsmittel hergestellt worden ist; die Einführung von LovD9 in den Fertigungsprozess im Jahr 2012 änderte sich dies , was zu einer deutlich effizienter und umweltfreundliche Alternative zur chemischen Herstellungsverfahren .

" Denn es ist ein enzymatischer Prozess , keine giftigen Chemikalien oder überschüssige organische Lösungsmittel verwendet werden ", sagte Tang , der die EPA Presidential Green Chemistry Challenge Award im Jahr 2012 für seine Arbeit mit Codexis erhalten .

Während der Arbeit an Simvastatin mit LovD9 vorgesehen klare Vorteile , die Gründe, warum das mutierte Enzym arbeitete so viel besser als das natürliche blieb unklar. So Tang wandte sich an Kollegen Kendall Houk und Todd Yeates , beide Professoren der Chemie und Biochemie an der UCLA , um zu sehen, ob sie ihr Know-how zu verbinden , um mit einer Erklärung .

Cracking the Struktur Geheimnis

" Es gibt viele verschiedene Beispiele für gerichtete Evolution verwendet wird, um Katalysatoren, die die Geschwindigkeit des gewerblichen oder Syntheseverfahren zu verbessern produzieren , aber die Tatsache , dass Sie ein guter Katalysator haben keine Informationen darüber, wie es funktioniert geben Ihnen ", sagte Houk .

Um die molekularen Strukturen von LoVD und LovD9 bestimmen wuchs Yeates ' Labor Proteinkristallen von jedem Enzym und gestreuten Röntgenstrahlen aus von ihnen in einem Prozess namens Röntgen-Kristallographie . Diese Messungen ergaben Yeates eine eingehende Blick auf die molekulare Architektur der Enzyme , doch beide erschienen nahezu identisch , ohne offensichtliche strukturelle Veränderungen zu erklären, warum LovD9 effizienter war .

Während die beiden Enzyme könnte ähnlich aussehen , wenn sie in feste Kristallform , ganz anders als in Wasser eingetaucht verhalten sie sich , sagte Houk . Die Enzyme werden aus langen Ketten von Aminosäuren, die drehen und drehen , wenn erlaubt, sich frei zu bewegen , doch ist diese komplexe Bewegungs nicht leicht durch Experimente im Labor beobachtet werden zusammengesetzt .

Um diese kleinsten molekularen Schwankungen zu quantifizieren , Houk und Jiménez- Osés verwendet ein Computerprogramm, das , wie die mutierten und natürliche Enzyme unterziehen inneren Bewegungen beim Auflösen in Wasser simuliert , und wie diese Bewegung wird die Fähigkeit der Enzyme , um die Transformation , die Simvastatin synthetisiert verursachen beeinflussen .

Bestimmen , warum das mutierte LovD9 Enzym funktioniert besser als ihre natürlichen Gegen beteiligten Simulieren der Bewegung des komplexen Enzyms in einer flüssigen Umgebung über einen Zeitraum gerade lang Mikrosekunden . Eine Mikrosekunde kann wie ein sehr kurzer Zeit erscheinen, aber Berechnungen für die Bewegung einer so großen Molekül benötigt massive Rechenressourcen, sagte Houk .

Das Team war in der Lage, die enorme Menge an Rechenleistung für diese Berechnungen mit der National Science Foundation geförderten Anton Supercomputer durch die DE Shaw Forschungslabor entwickelt und an der Pittsburgh Supercomputing Center notwendig zu nutzen.

"In den Maschinen, die wir für unsere Routineberechnungenhaben , nimmt jede der Simulationen in diesem Zeitrahmen mehr als einen Monat ", sagte Jiménez- Osés . " Mit Anton , können wir die gleiche Menge an Berechnungen in einem Tag zu tun . Es ist eine enorme Verbesserung . "

Aus den Ergebnissen der Computersimulation , Houk Jimenez - Osés bestimmt , dass ein Teil dessen, was das mutierte Enzym so wirksam ist, dass es ohne die Einbeziehung eines zusätzlichen Proteins , das durch das natürliche Enzym benötigt wird funktionieren . Auch die mutierten Enzym bewegt und dreht in der Weise, dass es in einer Konfiguration vorteilhaft für Simvastatin Produktion weit häufiger als ihre natürlichen Gegen bleibt .

Diese Berechnungen konnte das Forschungsteam zu verstehen, wie Mutationen weit vom aktiven Teil des Enzyms befindet, kann seine Leistung zu verbessern .

" Die gerichtete Evolution ändert sich die Art der Aminosäuren , die in der Protein ", sagte Houk . " Die Molekulardynamik -Simulationen konnten wir verfolgen, wie diese Veränderungen der Aminosäuren verändert die Struktur des Proteins und machte es für die Verwendung als Katalysator geeignet. "

Im Fall von LovD9 machen diese kleinen Unterschiede der Reaktion in der Herstellung von Simvastatin erheblich effizienter. Nun, da sie wissen, welche Strukturmerkmale im mutierten Enzym zur Verbesserung der Simvastatin- Produktion, hofft das Team , um ein Enzym mit ähnlichen Eigenschaften direkt zu konstruieren , ohne auf die mehr zufällige gerichtete Evolution Prozess .

" Das Besondere an dieser Studie ist, dass wir untersucht , was während der gerichteten Evolution passiert , um zu versuchen zu verstehen, wie diese Verbesserungen innerhalb des Proteins gemacht", sagte Yeates . "Wir hoffen, in der Zukunft , dass es möglich sein könnte , um eine bessere Enzyme in rationaler Weise durch das Verständnis , wie es in zufälliger Weise tritt zu machen. "

Das Geheimnis hinter dem mutierten LovD9 Enzym kann ohne ein außerordentliches Maß an Zusammenarbeit zwischen Chemie und Biochemie Forscher abteilungsübergreifend an der UCLA ungelöst geblieben.

"Dieses Projekt wäre ohne vier Gruppen zusammenkommen, um zu versuchen, ein Problem, das wirklich schwierig wird durch die Kombination ihrer unterschiedlichen Spezialitäten und Techniken zu lösen abgeschlossen zu haben", sagte Jiménez- Osés . "Durch die Zusammensetzen dieses Puzzles von biochemischen , Engineering , strukturellen und molekularen Dynamik Winkel , war es möglich, auf ein ziemlich zusammenhängendes Bild darüber, wie die gerichtete Evolution Prozess in diesem Fall funktionierte kommen" Yeates aufgenommen.