Die Fähigkeit, eine Arbeitskopie eines fehlerhaften Gens in das Genom eines Patienten Pop ist eine verlockende Ziel für viele Kliniker die Behandlung von genetischen Krankheiten . Jetzt haben Forscher an der Stanford University School of Medicine einen neuen Weg für die Durchführung dieser genetischen Fingerfertigkeit entwickelt .
Der Ansatz unterscheidet sich von dem anderer stammte Techniken , da sie nicht die Co- Verabreichung eines Enzym eine Endonuklease , um DNA des Empfängers an spezifischen Stellen Clip erforderlich. Es ist auch nicht auf die Co- Insertion von genetischem "ein" Schalter als Promotoren bezeichnet , um der neuen Genexpression aktivieren verlassen.
Diese Unterschiede können machen der neue Ansatz sicherer und langlebiger . Verwendung der Technik waren die Stan Forscher die Mäuse mit Hämophilie , indem ein Gen für einen Gerinnungsfaktor fehlt bei den Tieren zu heilen.
"Es scheint, dass wir in der Lage, das lebenslange Expression des inserierten Gens , was besonders wichtig ist bei der Behandlung von genetischen Krankheiten wie Hämophilie und schweren kombinierten Immun zu erreichen ", sagte Mark Kay , MD, PhD, Professor für Pädiatrie und der Genetik . "Wir sind in der Lage, dies ohne die Verwendung von Promotoren oder Nukleasen , die die Chancen der Krebserkrankungen, die entstehen können, wenn das neue Gen fügt sich zufällig Orten im Genom reduziert deutlich machen."
Mit der Technik waren Kay und seine Kollegen in der Lage, eine Arbeitskopie von einem fehlenden Blutgerinnungsfaktorsin die DNA von Mäusen mit Hämophilie einfügen. Obwohl die Insertion wurde in nur etwa 1 Prozent der Leberzellen bewerkstelligt , machte diese Zellen genug des fehlenden Gerinnungsfaktors , um die Störung zu mildern .
Kay ist der leitende Autor der Forschung, die in Nature veröffentlicht werden. Der federführende Autor ist Postdoc-Stipendiat Adi Barzel , PhD.
Eine mögliche Alternative zur CRISPR
Die Stanford Entdeckung könnte eine Alternative zu einem Genom - Bearbeitung Technik namens CRISPR / Cas9 , die auf einer alten , schützende Immunantwort , die durch Bakterien zu bekämpfen viralen Angriff entwickelt beruht bieten . Jedes Mal, wenn ein Bakterium, ein Virus besiegt , es spart einen winzigen Teil des Eindringlings DNA in seinem eigenen Genom , wie ein genetischer Feder in seiner Kappe . ( Anhäufung dieser viralen Regionen geclustert regelmäßig beabstandeten kurzen Palindrom- Regionen oder CRISPR genannt . ) Wenn das Virus wieder kommt , verwendet der Zelle die Auszüge gespeichert Erbgut zu identifizieren und klammern sich an passenden Regionen des viralen Genoms . Sobald angebracht , schneidet sie die viralen Gene an genauen Stellen mit einem Protein namens Cas9 .
Forscher auf der ganzen Welt haben begonnen, die CRISPR / Cas9 Technik zu verwenden , nicht nur dauerhaft Gene für Studie an Labortieren zu deaktivieren, sondern auch neue , modifizierte Gene in Genomen der Tiere einzusetzen. Dies ermöglicht die schnelle Erstellung von gentechnisch veränderten Versuchstieren ; was früher Monate oder Jahre dauern kann nun Tage oder Wochen dauern .
Die Technik erfordert jedoch nicht nur das Gen für das Cas9 Nuklease sein könnte, das in das Genom des Empfängers integriert werden , sondern auch einen Promotor , um die Expression der Gene anzutreiben. Forscher sind besorgt, dass , wenn bei Menschen verwendet , Cas9 kann die DNA an unerwarteten Orten , die stören oder töten die Zelle könnte geschnitten. Alternativ könnte der Promotor des neuen Gens beeinträchtigen die Expression von Genen in der Nähe , wodurch Krebs oder anderen Krankheiten. Die ausländischen bakterielle Proteine könnten auch dazu führen, eine Immunreaktion bei Patienten .
"Site - spezifische Gen-Targeting ist eine der am schnellsten wachsenden Bereiche in der Gentherapie und Gentechnik ", sagte Barzel . "Aber die Verwendung von Nukleasen und Promotoren können erhebliche nachteilige Auswirkungen . I , um mit einem neuartigen Gen - Targeting- System , das keine vektorübertragenen Promotors beteiligt und die Verwendung einer Endonuklease nicht verlangen wollte . "
Die Technik, die von den Forschern entwickelt benutzt weder Nukleasen , die DNA noch einen Promotor , um die Expression des GerinnungsfaktorgensAntriebs führen. Stattdessen haben die Forscher hitch die Expression des neuen Gens der eines stark exprimierten Gens in der Leber genannt Albumin. Das Albumin -Gen macht die Albumin -Protein, welches das häufigste Protein im Blut ist . Es hilft, das Blutvolumen zu regulieren und zu ermöglichen, Moleküle , die nicht leicht in Wasser auflösen müssen , um im Blut transportiert werden.
Die Forscher verwendeten eine modifizierte Version eines Virus allgemein in der Gentherapie genannt adeno- assoziiertes Virus oder AAV verwendet . In der modifizierten Version, genannt ein viraler Vektor, alle viralen Gene entfernt werden und nur die therapeutischen Gene verbleiben . Sie verließen sich auch auf ein biologisches Phänomen wie die homologe Rekombination , um den Gerinnungsfaktor -Gen in der Nähe des Albumingens legen bekannt. Durch die Verwendung eines speziellen DNA-Linker zwischen den Genen , die Forscher konnten , um sicherzustellen, dass die Gerinnungsfaktor -Protein wurde Hand in Hand mit der stark exprimierten Albuminprotein hergestellt .
Während der homologen Rekombination , die eine natürliche Reparaturvorgang ist , wird die Zelle nutzt den Vorteil der Tatsache, dass es zwei Kopien von jedem Chromosom . Durch Aneinanderreihung der beschädigten und unbeschädigt Chromosomen kann die Zelle von der Krippe intakte Kopie , um den Schaden , ohne lebenswichtige genetische Information zu reparieren. Kay und Barzel verwendet diesen natürlichen Prozess der Rekombination mit Sequenzen aus dem viralen Vektor in das Genom an Orten von den Forschern bezeichnet Kopieren - in diesem Fall wird nach dem Albumingens .
Wirksam bei Neugeborenen und erwachsenen Mäusen
Wenn sie ihren Ansatz bei neugeborenen Mäusen mit Hämophilie getestet , fanden sie , dass die Tiere begannen Ebenen des Gerinnungsfaktors , die zwischen 7 und 20 Prozent der normalen waren auszudrücken. Diejenige Menge des Gerinnungsfaktors in früheren Studien wurde gezeigt, therapeutische bei Mäusen zu sein . Sie zeigten ferner überraschenderweise gezeigt, dass die Technik gearbeitet sowie in adulten Tieren , obwohl das Gen erfolgreich in weniger als 1 von 100 Leberzellen eingesetzt .
"Wir erwarten, diesen Ansatz am besten bei neugeborenen Tieren zu arbeiten , weil die Leber wächst weiter ", sagte Kay , der auch der Dennis Farrey Familie Professor für Pädiatrie . " Da jedoch der homologen Rekombination ist gedacht worden, um in proliferierenden Zellen meist auftreten , haben wir nicht erwarten, dass es so gut wie es bei erwachsenen Tieren hat zu arbeiten."
Kay hat in der Gentherapie für die Hämophilie seit vielen Jahren beteiligt. Im Jahr 2006 war er als Leiter eines Teams von Forschern , die AAV verwendet, um eine Gerinnungsfaktor -Gen bei Patienten mit Hämophilie B. Diese Form der Hämophilie ist seltener als Hämophilie A , die ungefähr 1 in jeden 25.000 neugeborene Jungen betrifft liefern (da die Zustand wird durch ein fehlerhaftes Gen auf dem X-Chromosom verursacht , es selten betrifft Mädchen ) . Ist die Hämophilie B ist jedoch ein leichteres Ziel zu behandeln, weil das Gen, das für den fehlenden Gerinnungsfaktor ist kleiner und leichter, mit Gentherapie manipulieren.
Wie bei vielen Viren gibt es verschiedene Stämme von AAV . Leider ist die Expression des Gerinnungsfaktors mit dem Stamm von AAV in der Studie von 2006 verwendet dauerte nur einige Monate bei Menschen , im Gegensatz zu den langlebigen Expression in Tieren. Kürzlich ein anderes, ähnliches klinische Studie wurde in Großbritannien eingeführt mit einem anderen Stamm von AAV , und die Expression des Gerinnungsfaktors noch in jedem der sechs Personen beobachtet nach dem Empfang des modifizierten Virus behandelt mehr als zwei Jahre . Doch in diesen beiden Studien , die Gerinnungsfaktor -Gen wurde nicht in das Genom eingefügt , wurde aber stattdessen als eine separate , frei schwebende Kopie erhalten.
" Das eigentliche Problem mit AAV ist, dass es unklar, wie lange die Genexpression dauern wird , wenn das Gen nicht in das Genom integriert ", sagte Kay , der auch ein Mitglied des Stanford Cancer Institute, der Stanford Child Health Research Institute und der Stanford Bio X. " Säuglinge und Kinder , die am meisten von der Behandlung profitieren würden , noch wachsen, und eine nicht-integrierten Gens konnte seine Wirksamkeit zu verlieren , weil es nicht von Zelle zu Zelle kopiert. Darüber hinaus ist es nicht möglich , wiederholte Gabe die Behandlung , weil Patienten entwickeln ein Immunantwort auf AAV . Aber mit der Integration konnten wir das lebenslange Ausdruck , ohne Angst vor Krebserkrankungen oder anderen DNA-Schäden zu bekommen. "
Die Forscher planen nun , die Technik in Mäusen, die mit Leber aus Human- und Mauszellen , ein Modell, das sie vor kurzem konnten zeigen, kann ein guter Ersatz , weitere vorherzusagen, was in den Menschen geschehen sein gemacht zu testen.