Seit Jahren haben Neurowissenschaftler versucht, Werkzeuge, die es ihnen ermöglichen, die Schaltkreise des Gehirns deutlich zu sehen in Aktion zu entwickeln - vom ersten Moment an ein Neuron feuert auf die resultierende Verhalten in einem ganzen Organismus. Um dieses Gesamtbild zu bekommen, sind Neurowissenschaftler zusammen, um eine Reihe neuer Instrumente zu entwickeln , um das Gehirn zu studieren. Forscher am Caltech haben ein solches Tool, das eine neue Art der Kartierung neuronaler Netze in einem lebenden Organismus bietet entwickelt.
Die Arbeit - eine Zusammenarbeit zwischen Viviana Gradinaru (BS 05 ) , Assistant Professor für Biologie und Bio-Engineering und Frances Arnold, der Dick und Barbara Dickinson Professor für Chemische Verfahrenstechnik , Ingenieurbiologie und Biochemie - wurde in zwei separate Papiere veröffentlicht in diesem Monat beschrieben .
Wenn ein Neuron in Ruhe ist , die Kanäle und Pumpen in der Zellmembran eine zellspezifische Gleichgewicht von positiv und negativ geladenen Ionen innerhalb und außerhalb der Zelle , was zu einer stabilen Membranspannung genannt Ruhepotential der Zelle zu halten. Allerdings, wenn ein Reiz erkannt wird - zum Beispiel, ein Duft oder eine Sound - Ionen Hochwasser durch neu offenen Kanälen was eine Änderung der Membranspannung . Neuronalen Impuls, der Kreislauf -Aktivität in Bewegung setzt - Diese Spannungsänderung wird oft als ein Aktionspotential manifestiert .
Die durch Gradinaru und Arnold entwickelte Tool erkennt und dient als Marker dieser Spannungsänderungen .
"Unser übergeordnetes Ziel für dieses Werkzeug war , um Sensor neuronaler Aktivität mit Licht statt der traditionellen Elektrophysiologie zu erreichen, aber dieses Ziel hatte ein paar Voraussetzungen ", sagt Gradinaru . " Der Sensor hatte , schnell zu sein , denn Aktionspotentiale geschieht in nur Millisekunden. Auch hatte der Sensor sehr hell , so dass das Signal mit bestehenden Setups Mikroskopie nachgewiesen werden. Und Sie müssen in der Lage, gleichzeitig studieren die mehrere Neuronen , dass bilden ein neuronales Netzwerk . "
Die Forscher begannen durch die Optimierung Archaerhodopsin (Arch ) , ein lichtempfindliches Protein aus Bakterien. In der Natur Opsinen wie Arch erkennen Sonnenlicht und die Mikroben Bewegung in Richtung der Licht initiieren , so dass sie die Photosynthese beginnen. Allerdings können die Forscher auch die lichtreaktions Qualitäten Opsine für ein Exploit Neurowissenschaften Methode namens Optogenetik - , in denen Nervenzellen eines Organismus genetisch verändert werden , um diese mikrobiellen Opsinen auszudrücken. Dann , indem einfach ein Licht auf den modifizierten Neuronen können die Forscher die Aktivität der Zellen, sowie deren zugehörige Verhalten im Organismus zu steuern.
Gradinaru zuvor entwickelt Bogen für bessere Verträglichkeit und Leistungsfähigkeit in Säugerzellen als traditionelles optogenetische Werkzeug benutzt, um das Verhalten eines Organismus mit Licht zu steuern war. Wenn die modifizierten Neuronen gegenüber grünem Licht ausgesetzt ist, wirkt Arch als Inhibitor , Kontrolle neuronaler Aktivität - und damit auch die damit verbundenen Verhaltensweisen - durch die Verhinderung der Neuronen vor dem Brennen .
Jedoch waren Gradinaru und Arnold meisten interessiert andere Eigenschaft Arch: wenn Rotlicht ausgesetzt , wirkt das Protein als ein Spannungssensor , der Reaktion auf Veränderungen in der Membranspannungendurch Erzeugung eines Lichtblitzes in Gegenwart eines Aktionspotentials . Obwohl diese Eigenschaft könnte im Prinzip erlauben Arch , die Aktivität der Netzwerke von Nervenzellen zu erfassen, war die Lichtsignal -Kennzeichnung dieses neuronale Aktivität oft zu schwach , um zu sehen .
Um dieses Problem zu beheben , Arnold und ihre Kollegen aus den Arch Protein heller mit einer Methode namens gerichtete Evolution - eine Technik, Arnold ursprünglich in den frühen 1990er Jahren Pionierarbeit geleistet. Die Forscher eingeführten Mutationen in den Arch Gen , wodurch Millionen von Varianten des Proteins kodiert. Sie übertragen die mutierten Gene in E. coli Zellen, die die mutierten Proteine, die von den Genen kodiert werden produziert. Sie gesiebt dann Tausende der resultierenden E. coli-Kolonien für die Intensitäten der Fluoreszenz. Die Gene für die hellsten Varianten wurden isoliert und zur weiteren Runden der Mutagenese und Screening unterzogen, bis die hergestellten Proteine, die das 20-fache heller als die Original Arch Protein wurden Bakterien.
Eine Papier den Prozess und die hellen neuen Proteinvarianten , die erstellt wurden beschreiben wurde in den Proceedings der National Academy of Science.
" Dieses Experiment zeigt , wie schnell sich diese bemerkenswerten bakterielle Proteine können als Reaktion auf neue Anforderungen zu entwickeln. Aber noch spannender ist, was sie tun können, in Nervenzellen , wie Viviana entdeckt ", sagt Arnold .
In einer separaten Studie von Gradinaru die Doktoranden Nicholas Flytzanis und Claire Bedbrook , der auch von Arnold beraten geführt wird , die Forscher genetisch integriert die neue , hellere Arch Varianten in Nagetier Neuronen in Kultur zu sehen, welche dieser Versionen am empfindlichsten auf Veränderungen Spannung wurde - und daher wäre die beste auf die Erkennung von Aktionspotentialen sein . Einer Variante Archer1 , war nicht nur helle und empfindlich genug, um Aktionspotentiale in Säugerneuronenin Echtzeit zu kennzeichnen, es kann auch verwendet werden, um festzustellen, welche Neuronen wurden synaptisch verbunden werden - und die miteinander in Verbindung - in einer Schaltung .
Die Arbeit wird in einer Studie in der Zeitschrift Nature Communications veröffentlicht beschrieben .
"Was war interessant ist , dass wir sehen, zwei Zellen hier leuchten , aber nicht diese dort - weil die ersten beiden sind synaptisch verbunden ", sagt Gradinaru . "Dieses Tool hat uns einen Weg, um ein Netzwerk, in dem die Störung einer Zelle eine andere beeinflusst zu beobachten. "
, Erfassen Aktivität in einem lebenden Organismus und Korrelieren diese Aktivität mit Verhalten blieb jedoch die größte Herausforderung . Um dieses Ziel zu Gradinaru -Team arbeitete mit Paul Sternberg, der Thomas Hunt Morgan Professor der Biologie zu erreichen, um Archer1 als Sensor in einem lebenden Organismus zu testen - der winzigen Fadenwurm C. elegans. " Es gibt ein paar Gründe, warum wir verwendet die Würmer sich hier: Sie sind leistungsstark Organismen für schnelle Gentechnik und deren Gewebe sind fast transparent, macht es einfach, das fluoreszierende Protein in einem lebenden Tier zu sehen ", sagt sie .
Nach Einarbeitung Archer1 in Neuronen , die ein Teil des Wurms olfaktorische System wurden - eine primäre Quelle für sensorische Informationen für C. elegans - die Forscher ausgesetzt den Wurm zu einem Geruchsstoff . Wenn der Geruchsstoff vorhanden war , wurde eine Grundlinienfluoreszenzsignalzu sehen ist, und wenn der Geruchsstoff entfernt worden war, konnten die Forscher die Schaltung von Neuronen zu sehen leuchtet , was bedeutet, dass diese speziellen Nervenzellen in Gegenwart des Stimulus in Abwesenheit des unterdrückten und aktive der Reiz . Das Experiment war das erste Mal , dass eine Variante Arch war verwendet worden, um eine aktive Schaltung in einem lebenden Organismus zu beobachten.
Gradinaru nächsten hofft, Tools wie Archer1 verwenden, um die komplexen neuronalen Netzwerken von Säugetieren , besser zu verstehen , mit mikrobiellen Opsinen als Sensor- und Betätigungswerkzeugein optogenetically geändert Nagetiere.
"Für die Zukunft arbeiten, ist es sinnvoll , dass dieses Tool bifunktionelle . Obwohl Archer1 fungiert als Spannungssensor unter Rotlicht , mit grünem Licht , es ist ein Inhibitor ", sagt sie . "Und so jetzt ein langfristiges Ziel für unsere Optogenetik Experimente ist es, die Werkzeuge mit verhaltenssteuernden Eigenschaften und die Werkzeuge, mit Spannung fühlenden Eigenschaften zu kombinieren. Dies würde es uns ermöglichen, rein optischen Zugang zu neuronalen Schaltkreisen zu erhalten. Aber ich denke, es gibt ist immer noch eine Menge Arbeit vor uns . "
Ein Ziel für die Zukunft, Gradinaru sagt, Archer1 noch heller zu machen. Obwohl Fluoreszenz des Proteins können durch die nahezu transparente Gewebe des Fadenwurms zu sehen ist, sind opak Organen wie dem Gehirn von Säugetieren noch eine Herausforderung . Mehr Arbeit , sagt sie, benötigen zu tun, bevor Archer1 könnte verwendet werden, um Spannungsänderungen in den Neuronen des Lebens zu erkennen , verhalten Säugetieren werden.
Und das wird weitere Zusammenarbeiten mit Protein -Ingenieure und Biochemiker wie Arnold erfordern .
"Als Neurowissenschaftler gibt es oft experimentellen Barrieren , die das Potenzial für neue Methoden zu öffnen. Wir haben uns dann zusammenarbeiten, um Werkzeuge oder durch Chemie Instrumentierung zu erzeugen , und bestätigen wir sie und schlägt Optimierungen , und es hält gerade gehen ", sagt sie . " Es gibt ein paar Dinge, die wir gerne besser zu sein, und durch diese viele Iterationen und die harte Arbeit es kann passieren. "