Zum ersten Mal gesehen - ALIX rekrutiert in HIV angeh

University of Utah Forscher entwickelten eine Möglichkeit, neu zu sehen bilden AIDS Viruspartikel Schwellen- oder " angehenden " von infizierten menschlichen Zellen ohne Störung des Prozesses. Das Verfahren zeigt ein Protein mit dem Namen ALIX wird während der letzten Phasen der Virusreplikation , nicht früher beteiligt, da bisher angenommen wurde .

" Wir beobachten eine Zelle zu einer Zeit " und verwenden Sie eine Digitalkamera und speziellen Mikroskop , um Filme und Fotos der angehenden Prozess zu machen , sagt der Virologe Saveez Saffarian , Assistant Professor für Physik und Astronomie und leitende Autor einer neuen Studie von HIV angehende in der Public Library of Science Fachzeitschrift PLoS ONE veröffentlicht online heute .

"Wir sahen ALIX rekrutiert in HIV angeh zum ersten Mal ", sagt er . " Jeder wusste, ALIX in HIV angeh beteiligt , aber niemand konnte die Rekrutierung von ALIX in den Prozess sichtbar zu machen. "

Das Ergebnis ist " grundlegende Grundlagenforschung " und hat keine unmittelbare klinische Bedeutung für AIDS-Patienten , weil ALIX ist in zu viele kritische Funktionen wie Zellteilung beteiligt , um ein mögliches Ziel für neue Medikamente , sagt Saffarian .

"Wir wissen eine Menge über die HIV- Proteine, die aus der Zelle zu helfen, aber wir wissen nicht, wie sie zusammenkommen , um das Virus zu bekommen , und es wird in den nächsten 10 bis 20 Jahren , dass wir viel wissen mehr von diesen Mechanismus ", fügt er hinzu. " Wäre dies ein Medikament Ziel sein? Würde dies ein Teil der Biochemie später in einem therapeutischen oder Biotech-Industrie verwendet werden ? Ich kann jetzt nicht sagen. Aber wenn es wegen unserer Neugier als Spezies nicht , hätten wir nicht die Technologie, die wir heute haben. "

Die neue Studie " ist schön Arbeit", sagt HIV angehende Experten Wes Sundquist , der Saffarian beraten und ist Professor und Co-Vorsitzender der Biochemie an der University of Utah School of Medicine. "Es ist von echtem Interesse für diejenigen von uns, die den Mechanismus der HIV Montage zu studieren. "

Die Studie wurde von der National Science Foundation . Saffarian die die Studie mit der erste Autor , Pei- I Ku, eine Universität von Utah Doktorand der Physik ; Mourad Bendjennat , ein Postdoctoral Fellow in Physik und Astronomie ; Techniker Jeff Ballew ; und Michael Landesman , ein anderes Postdoc in Physik und Astronomie , die zuvor in Sundquist der Biochemie-Labor arbeitete .


Die obere Reihe zeigt, von links nach rechts , rot -markierten Protein-Moleküle namens Gag ( hier gezeigt in schwarz und weiß) die Montage , einen neuen HIV-Partikel , die Knospen von einer menschlichen Zelle im Labor gezüchtet zu bilden. Die untere Reihe zeigt den gleichen Prozess , aber mit Proteinen namens ALIX beschriftet grün (auch in schwarz und weiß) . Zusammen bilden die beiden Sequenzen (oben gezeigt Minuten und Sekunden) zeigen, wie ALIX wird spät in den Prozess eingebunden als Gag versammelt , um ein neues Teilchen von HIV, das AIDS verursacht zu bilden. Diese Feststellung einer neuen Universität von Utah Studie widerspricht früheren Untersuchungen , die ALIX vorgeschlagen hatte, wird zu einem früheren Zeitpunkt in der HIV angehenden Prozess beteiligt.
Bildnachweis: Pei- I Ku, University of Utah .

Uhr, Do not Touch , wie HIV -Knospen

Biochemische Methoden seit Jahren verwendet beinhalten Sammel Millionen von Viren in Laborglaswaren und dabei verschiedene Analysen , um die Proteine ​​, die das Virus zeigen - zum Beispiel durch Verwendung von Antikörpern , die an bestimmte Proteine ​​binden und mit anderen Proteinen , die die ersten Proteine ​​fluoreszieren , so dass sie machen gesehen werden kann.

"Du bist nicht tun es ein Virus in einer Zeit ", sagt Saffarian . " Das Problem mit diesem ist, dass Sie nicht sehen, die Unterschiede zwischen ähnlichen Viren. Und Sie nicht sehen, das Timing , wie verschiedene Proteine ​​kommen und gehen , um das Virus aus der Zelle zu erhalten. "

Weitere Verfahren einfrieren oder anderweitig beheben Zellen als HIV- Partikel ergeben sich aus ihnen , und verwenden Sie ein Elektronenmikroskop , jene Standbild Blick auf die virale Replikation zu fotografieren. Saffarian nutzt Technologie als " Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie", die verwendet wurde, um bei dynamischen Prozessen in Zellen unterscheiden bekannt.

Die Methode wurde zuvor verwendet , um Bilder der Knospung von HIV und ähnlicher Pferdevirus , EIAV machen . Aber Saffarian sagt Studie nicht zeigen ALIX immer in HIV beteiligt angehende und hatte Fehler, die falsch angegeben das ALIX Protein wurde schon sehr früh in der EIAV angehenden Prozess beteiligt , was darauf hindeutet, es ist die gleiche in HIV angeh taten.

Ku, Saffarian und Kollegen kombiniert , dass die Mikroskopierverfahren mit einer verbesserten Weise gentechnisch Verknüpfung eines grün fluoreszierenden "label" , um ALIX Proteine ​​in geklonten Zellen , so dass sie die Proteine ​​ohne Beeinträchtigung ihrer normalen Funktion zu sehen. Die Forscher versuchten zahlreiche sogenannte " Linker " und festgestellt, die eine, die ihnen die ALIX Proteine ​​zu sehen, wie sie wurden in HIV angeh aber ohne den Prozess zu stören beteiligt lassen .

Weder die Mikroskop -Technologie noch Markierung von Proteinen mit grüner Fluoreszenz sind neu, aber " was wir getan haben , was neu ist, wir verknüpft diese Fluoreszenzproteine​​ALIX mit vielen verschiedenen Arten von Linkern " , eine, die die ALIX Proteinfunktion korrekt ließ zu finden , fügt er hinzu.

Das Problem bei früheren Untersuchungen - das für die ALIX wurde Anfang des angehenden Prozess beteiligt - war , dass nur ein Linker verwendet wurde , und es ist die normale Funktion ALIX " beeinträchtigt , sagt Saffarian .

Mit Blick auf Proteine ​​Forming HIV

Bei HIV- Replikation in einer menschlichen Zelle , ist ein Protein namens Gag bis die meisten der neuen Teilchen - es gibt 4.000 Kopien des Gag-Proteins in einem HIV-Partikel - obwohl eine Reihe von anderen Proteinen zu engagieren in den Prozess , einschließlich ALIX , das steht für " alg -2 interagierende Protein x . " Experimente , wie sie von Saffarian Team Verwendung " virusähnliche Partikel ", die HIV-Partikel ihrer genetischen Bauplan oder Genom abgestreift , so dass sie ein Infektionsrisiko im Labor nicht gefährden können.

"Virus -ähnliche Partikel halten die gleiche Geometrie und gleiche angehenden Verfahren infektiösen HIV ", sagt Saffarian .

Während angeh , montieren Gag-Proteinen an der Innenseite der Zellmembran - zusammen mit ALIX in den späten Stadien - und bilden eine neue HIV-Partikel , die ihren Weg aus der Zelle drückt - das Verfahren, mit dem AIDS in einer infizierten Person breitet sich von Zelle zu Zelle.

Am Knospungsvorgang suchen, Ku, Saffarian und Kollegen platzieren menschlichen HeLa-Zellen , die die Teilchen in einer kleinen Menge des flüssigen Wachstumsmedium in einer Petrischale, und setzt es unter dem Mikroskop , das in einer Glaskammer gehalten wird bei Körpertemperatur , so dass die Zellen für mehr als 48 Stunden am Leben bleiben . Ein Festkörper- blauen Laser wird auf die Probe ausgerichtet , damit die aus grün-markierten ALIX und rot -markierten Gag Proteine ​​leuchten oder fluoreszieren , damit sie sehen , wie sie in ein Viruspartikel zusammenzustellen.

Mit rot -markierten Gag-Proteinen und grün -markierte Proteine ​​ALIX , mit rund 100 ALIX Proteine ​​konvergieren mit den rund 4.000 Gag -Moleküle und der Montage in eine neue HIV-Partikel ", konnten wir sehen, ALIX kommen am Ende der Montage der Viruspartikel " . ALIX bringt dann in zwei anderen Proteinen , die die angehende Viruspartikel von der Zelle abgeschnitten , wenn sich herausstellt . Position ALIX " während der Abschnüren von neuen Teilchen vorher nicht erkannt worden , sagt Saffarian

Die Forscher beobachteten die Viruspartikel Knospe von einer Zelle zu einer Zeit : ca. 100 von ihnen während einer zweistündigen Zeitraum entstanden. Saffarian sagt meisten ALIX Proteine ​​verlassen, als HIV Anordnung vollständig war und wieder in der Flüssigkeit im Inneren einer Zelle.

Er sagt, dass die Entdeckung, dass ALIX nicht zu engagieren , bis die späten Stadien der HIV angeh weist auf die Existenz eines bisher nicht berücksichtigten Mechanismus in dem Virus, das das Timing der ALIX und andere Proteine ​​beim Zusammenbau neue HIV-Partikel reguliert .

" Wir haben festgestellt , dass die zellulären Komponenten , die mit der Freisetzung des Virus helfen, tatsächlich in einem sehr viel komplexer Zeitschema als vorhergesagt auf der Basis der biochemischen Daten zu gelangen ", sagt Saffarian . " Die Ergebnisse dieser Studie sind vielversprechend , da sie entdeckt einen neuen Regulationsmechanismus für die Rekrutierung von zellulären Komponenten auf die HIV angehende Websites und öffnet die Tür zu spannenden zukünftigen Studien über den Mechanismus der HIV angehenden . "

Physiker in Virology

Warum Physiker studieren Viren ? Zuerst untersuchen biophysicists physikalischen Mechanismen in der Biologie, wie Motoren in den Zellen. Saffarian promovierte in Biophysik, die Entwicklung von Methoden , die Leuchtstofflampe verwendet werden, um bei zellulären Prozessen zu suchen.

"Ich habe sehr eifersüchtig, weil ich fühlte, jedes Mal wenn ich dazu beigetragen, ein Projekt , war die eigentliche Wissenschaft Verfolgung von jemand anderem ", sagt er . "Ich habe sie mit Werkzeugen zu helfen , aber nicht fragen, grundlegende Fragen selbst."

So Saffarian habe ein Postdoktoranden-Stipendium in der Zellbiologie an der Harvard Medical School , dann " entschied ich wollte , um Viren zu untersuchen, wie sie aus den Zellen zu erhalten und zu replizieren. " Zusätzlich zu seiner Position in der Physik, ist er ein Adjunct Assistant Professor für Biologie .

Ein 10-Sekunden- Video mit HIV angeh mit ALIX :

Endphase der HIV- Montage : Das 10-Sekunden- Film zeigt die Rolle eines Proteins namens ALIX ( mit einem fluoreszierenden Protein markiert grün) , wie es wird bei der Bildung oder beteiligt " angehenden " zwei neue menschliche Immunschwäche-Virus (HIV) Partikel aus einer menschlichen Zelle . Die neuen HIV-Partikel bestehen hauptsächlich aus einem Protein namens Gag gemacht . Der Film zeigt zwei Stellen (rot) , wo Gag ist die Montage an HIV-Partikel zu bilden. Es zeigt, dass aus grün-markierten Proteine ​​ALIX erhalten spät in den Prozess einbezogen , wenn sie in einer Flamme der grünen Farbe binden, um sich neu bildenden Viruspartikel ( Ausbau rote Punkte ) . Das ist das zentrale Ergebnis einer neuen Universität von Utah Studie Virologe Saveez Saffarian und Physik Doktorand Pei- I Ku geführt.
Bildnachweis: Pei- I Ku, University of Utah .